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生物学家将窃听病毒变成细菌刺客

中科院南海海洋所等:细菌用病毒分“敌我”

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普林斯顿大学的分子生物学家邦妮·巴斯勒和研究生贾斯汀·西尔佩已经发现了一种可以听细菌对话的病毒VP882

然后,就像间谍小说中的某种东西一样,他们找到了一种方法来使用它来制造它攻击大肠杆菌和霍乱等细菌性疾病。

“分子生物学的Squibb教授Bassler说:”病毒正在检测细菌用于通讯的分子 - 这是全新的。“贾斯汀发现了这个第一个自然发生的病例,然后他重新设计了这种病毒,以便他可以提供他选择的任何感官输入,而不是通信分子,然后病毒就会按需杀死。”他们的论文将刊登在1月10日的Cell杂志上。

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病毒只能做出一个决定,Bassler说:留在宿主或杀死宿主。也就是说,要么在其主机内部保持雷达,要么激活杀死序列,该序列会产生数百或数千个爆发的后代,杀死当前主机并向新主机发射。

选择杀戮选项存在固有风险:“如果附近没有其他主机,那么病毒及其所有亲属就会死亡,”她说。VP882已经找到了一种将风险排除在决策之外的方法。它听取细菌宣布它们在人群中,增加了当病毒杀死时,释放的病毒立即遇到新宿主的可能性。“这是辉煌和阴险的!”巴斯勒说。

“这篇论文为病毒与宿主之间的动态关系提供了一个全新的视角,”匹兹堡大学生物技术的Eberly家庭教授Graham Hatfull说,他没有参与这项研究。“这项研究第一次告诉我们......当一个噬菌体处于溶原性[停留]状态时,它不会”快睡着“,而是一只眼睛睁开,耳朵保持警觉,准备好在它听到时做出反应“表明细胞已准备好应对环境变化。”

Bassler也是分子生物学的主席,也是霍华德休斯医学研究所的研究员,多年前就已经发现,细菌可以相互沟通并感知彼此的存在,并等待他们在一致行动之前建立法定人数。但她从未想到病毒可以窃听这种群体感应通信。

本报讯传统意义上,病毒被认为是细菌的“敌人”。但定植在肠道中的细菌却可以通过病毒进行“自我识别”,即区分自己和其他细菌。近日,中国科学院南海海洋研究所王晓雪课题组和美国合作者在《细胞—报告》报道了细菌利用感染它们的病毒进行自我识别的新方式。这为细胞利用病毒将自己与近源竞争对手区分开来提供了第一个证据。

2019年5月30日,来自纽约洛克菲勒大学细菌学实验室的LucianoA. Marraffini团队在Nature杂志发表文章——Cas13-induced cellular dormancy prevents the rise of CRISPR-resistant bacteriophage,文章鉴定了Cas13介导的非特异性剪切RNA的能力能够剪切宿主和噬菌体表达的RNA,赋予宿主防御DNA病毒感染和抗CRISPR病毒感染的能力。

“臭虫越来越多,”她笑着说。“另外,贾斯汀的工作表明,这些群体感应分子正在跨越王国边界传递信息。”病毒与细菌不在同一个王国

事实上,它们不属于任何王国,因为它们在技术上并不存在。但是,对于这种根本不同的生物能够检测和解释彼此的信号简直令人难以置信,她说。它不像敌人互相监视,或者甚至像人类与狗交流

  • 至少是同一个王国的成员。

在找到这个跨王国窃听的第一个证据后,Silpe开始寻找更多 - 并找到了它。

“他刚刚开始了一个全新的领域,”巴斯勒说。“只有一个这样的跨领域交流的例子对我们没有任何意义。贾斯汀发现了第一个案例,然后,随着他的发现,他看起来更深入,他发现了一整套病毒类似的能力。他们可能并非都在听这个群体感应信息,但很明显,这些病毒可以收听他们主机的信息,然后利用这些信息杀死它们。“

Silpe说,由于她对细菌通讯的研究,他被吸引到巴斯勒实验室工作。“沟通似乎是一种进化的特质,”他说。“听到细菌可以做到这一点

  • 她的发现 - 你想到的有机体实际上能够进行交流,这真是令人兴奋。病毒甚至比细菌更简单。我研究的那种,例如它只有大约70个基因。将这些基因中的一个用于群体感应非常值得注意。通信显然不是高等生物创造的。“

一旦Silpe证明VP882正在窃听,他就开始尝试喂食它的错误信息,以便在命令下欺骗病毒

  • 将捕食者变成刺客。

VP882不是第一种用作抗菌治疗的病毒。捕食细菌的病毒被称为“噬菌体”,“噬菌体疗法”

  • 用噬菌体靶向细菌疾病 - 是一种已知的医疗策略。但VP882是第一个使用窃听来知道什么时候杀死其目标最佳的噬菌体,这使得Silpe在噬菌体治疗第一次使用跨性别交流时进行沙门氏菌和其他致病细菌的实验。

此外,这种病毒作为治疗工具具有巨大潜力,因为它不像典型的病毒,Bassler说。大多数病毒只能感染非常特殊类型的细胞。例如,流感病毒只感染肺细胞;HIV仅针对特定的免疫系统细胞。但是,病毒VP882具有“特别广泛的宿主范围”,Bassler说。到目前为止,Silpe只用三种不相关的细菌进行了“原理证明”测试:霍乱弧菌,沙门氏菌和大肠杆菌。这些疾病已经分开进化了数亿年,所以他们都对这种细菌刺客都很敏感这一事实表明它们还有很多甚至更多。

Hatfull也对这种重新设计的病毒对抗生素抗性细菌的效用持乐观态度。“抗生素耐药性显然是全球主要的健康威胁,对这一问题的新策略和方法有明确而明显的需求,”他说。“虽然我们已经发现即使达到天然噬菌体基本治疗用途的'一垒'也很棘手,但我们可以设想,如果我们能够设计具有非常特异性靶向治疗用途的噬菌体,就可能实现'本垒打'。”他说,这些病毒刺客甚至可能减缓抗生素耐药菌株的出现。

Bassler将这一发现归功于Silpe。在确定霍乱弧菌中新的群体感应基因后,他选择在基因组数据库中搜索该基因。它出现在一些霍乱相关的菌株和正好一种病毒。Bassler想知道这是否是一个毫无意义的数据工件,但是Silpe希望得到一个病毒标本并进行实验。

“他很高兴,我想,'到底是什么,给这个孩子一点绳子。如果这不能很快起作用,我们可以继续前进,'”她说。“他是一个疯狂的想法,因为从来没有,从来没有证据表明病毒会在细菌宿主信息中聆听决定是留下还是杀人。但这个实验室是建立在疯狂的想法上,就像细菌互相交谈,我们有一种谋生的方式......当然,普林斯顿的科学和科学的美丽,你有足够的资源来发挥这些预感,并看看那里是否有“那里”。而这一次那里有一个很大的'那里'。“

Justin Silpe和Bonnie Bassler撰写的“主机产生的群体感应自动诱导剂控制噬菌体裂解 - 溶解性决定”将于1月10日发表于Cell,并于12月13日在线发布。它得到了霍华德的支持休斯医学研究所,NIH Grant 2R37GM065859,国家科学基金会资助MCB-1713731,Max Planck Society-Alexander von Humboldt,以及国防部通过国防科学与工程研究生奖学金。

文章联合通讯作者、宾夕法尼亚州立大学教授Thomas Wood指出:“这意味着我们应该重新评估病毒与其细胞宿主之间的关系,因为有时病毒感染也可能是件‘好事’。”

细菌的CRISPR基因座是指被来源于噬菌体和质粒的短片段分隔开的30-40bp间隔重复的序列,它和功能与核酸加工相关的CRISPR相关蛋白共同组成细菌的免疫系统。CRISPR基因座可转录出并加工为short CRISPR RNAs ,介导Cas核酸酶靶向并破坏入侵噬菌体或质粒的互补序列,发挥免疫作用。根据效应核酸酶组成的亚基数量,CRISPR-Cas系统可以分为两类:第一类系统的核酸酶由多个亚基组成,根据crRNA加工复合体和核酸酶的组分是否存在交互,可进一步再分为Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ型;第二类系统的核酸酶由单一的,多功能的蛋白组成,并根据核酸酶的结构分为Ⅱ,Ⅴ,Ⅵ型。其中,Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,在分子诊断方面具有重要的应用价值。

王晓雪团队在准备细菌运动性平板时,发现不同的大肠杆菌K-12菌株之间在运动性平板上形成了分界线,而相同的克隆株之间并不会形成这种分界线。为揭示背后的机制,研究人员对完整大肠杆菌K-12中4296个单基因敲除的菌株进行了筛选。结果发现,当菌株中携带的突变基因影响到噬菌体复制所需的基因时,分界就完全消失了。

Cas13被报道既具有切割与crRNA互补的RNA间隔序列前体能力,还具有一种特殊的性质:它可以非特异性地剪切附带RNA,并且这一过程依赖于Cas13切割间隔序列前体的发生。但这一特性的生理意义目前未知。另一方面,通过分析表达Cas13的原核生物的spacer序列,发现其既靶向RNA病毒,又含有靶向双链DNA病毒的序列,说明Cas13在防御DNA病毒的过程中也起到重要作用,但如何发挥功能并不清楚。而这与Cas13的非特异剪切RNA的能力是否相关一直是研究者们关心的问题。

研究人员还发现,一个古老的隐匿型噬菌体CPS-53携带的YfdM蛋白,是负责细菌自我识别的关键蛋白。他们建议重新评估病毒与其他细胞宿主之间的关系,因为病毒感染可能在某些竞争条件下对宿主有利。

为研究Cas13的功能,作者首先在type VI-A CRISPR–Cas系统的天然宿主Listeria ivanovii中构建了Cas13介导的Listeriaivanovii ΩCRISPRVI抵御φRR4DNA噬菌体感染的模型。通过构建靶向φRR4全基因组的spacer文库,最终筛选到能够有效防御的三条spacer序列:靶向anti-CRISPR区域的spcA,靶向早期裂解基因的spcE和靶向晚期裂解基因的spcL。表达三条spacer序列能够有效降低病毒的感染中心效率和裂解量,说明Cas13能够介导宿主抵御DNA噬菌体的感染。

相关论文信息:DOI:

图1:Cas13a阻碍了DNA病毒感染。

《中国科学报》 (2019-04-22 第4版 综合)

鉴于三条spacer序列靶向的序列既包括病毒必需基因,也包括非必需基因,作者认为Cas13的非特异RNA剪切功能发挥了重要作用。因此,作者使用RNA-seq和RNA5’端鉴定的方法分析了噬菌体和宿主的转录产物以鉴定Cas13非特异RNA剪切功能的靶标。结果发现,噬菌体和宿主的转录产物都发生了普遍的断裂。没有观察到晚期裂解基因的表达可能是由于早期基因mRNA被剪切导致功能丧失进而无法激活晚期基因的表达。以上结果表明,Cas13可以广泛地剪切噬菌体和宿主的转录本mRNA。

图2:Cas13广泛剪切噬菌体和宿主的转录本。

作者发现,Cas13的激活显著抑制宿主的生长,但并不会导致宿主的死亡。并且,Cas13激活会导致宿主对抗生素的耐受,进一步证明Cas13激活导致宿主进入休眠状态。同时,将表达spcE的菌株与感染敏感菌株共培养,可以显著保护敏感菌株,说明Cas13限制噬菌体的增殖进而保护未感染的细胞群体。而使用外源质粒激活CRISPR-Cas13系统,也会保护宿主防御噬菌体的感染,这表明Cas13激活引起的休眠效应足以发挥对噬菌体感染的抵抗作用。以上实验说明,Cas13激活诱导宿主进入休眠状态,从而防御DNA噬菌体的感染。

图3:Cas13诱导宿主休眠进而抑制噬菌体增殖。

根据Cas13广泛的保护作用,作者猜测即使噬菌体群体中的部分个体发生自然突变,导致crRNA不能与靶向RNA配对,Cas13也能有效地中和这部分噬菌体。为验证此推测,作者构建不与spcA配对的φRR4acr和不与spcE配对的φRR4early两株突变噬菌体,并将其与野生型噬菌体按照1:105混合后感染细菌,发现Cas13能够有效的清除噬菌体,而单独感染突变噬菌体则不能发挥保护作用。混合另一株肌尾噬菌体A511也得到了类似的结果。相比Cas13,Cas9不具有类似的保护效应。

图4:Cas13激活抵御非靶标的噬菌体感染。

综上,作者鉴定了Cas13非特异剪切RNA的功能在宿主遭遇DNA病毒和突变破坏crRNA识别的病毒感染时发挥保护作用的机制:激活的Cas13非特异剪切宿主和噬菌体的转录本,减少噬菌体表达和宿主体内的病毒DNA复制必须因子,阻断病毒复制;同时诱导宿主进入休眠状态,进一步阻断噬菌体侵染未被感染的细菌。

关于噬菌体

噬菌体是侵袭细菌的病毒,也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方,如:泥土、动物的肠道里,都可以找到噬菌体。

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